En este proyecto se van reunir las condiciones materiales, científicas y de recursos humanos para la concretización y ejecución del método del RIBOGRAMA. Se deberán criar experimentalmente perfiles gráficos de los valores (“cantidad”) medios de ribosomas libres que van a ser fijados como normales, para que a partir de los cuales se pueda trazar una curva-mediana-padrón, del tipo de la ejemplificada en la figura del ribograma.

La curva normal de ribograma deberá ser definida con limites de amplitud, dentro de una zona considerada de normalidad, con base en los resultados de mediciones de concentraciones de ribosomas libres provenientes de colonocitos de la mucosa colorectal de personas adultas jóvenes sanas, con edades entre los veinte y los cincuenta anos, de quienes se obtendrán las muestras de heces para aislamiento de colonocitos.

Después de bien definidos los limites de la normalidad de las concentraciones de ribosomas libres será posible hacer estudios comparativos, lo que permitirá criar niveles de tendencias de la enfermedad maligna (por elevación de la curva) a partir de la secuencia de ciertos valores de los resultados encontrados.

El método es concebido para trabajar con productos de excreción del cuerpo humano, que en circunstancias corrientes y habituales son lanzadas en el sistema de alcantarilla publica. En el desarrollo del metodo no hay ningún procedimiento sobre el cuerpo humano, y la tramitación técnico-científica obedecerá al anonimato y confidencialidad medica en lo que respecta a la identificación de cada persona de la cual serán obtenidas las muestras de heces para estudio. De esta forma, no será posible a nadie saber a quien pertenecen las muestras de heces bajo trabajo de estudio laboratorial.

Para trazar los limites del estudio en la población diana hay que tener en cuenta que el cancer colorectal (CCR) esporádico (lo que no depende de características heredofamiliares) tiene esencialmente su aparición a partir de los cincuenta anos de edad.

Asi, para este estudio prospectivo, para la construcción de la curva grafica normal del ribograma y de los tramos de esa curva fuera de los limites de la normalidad, serán constituidos seis grupos de personas/pacientes, utilizando los siguientes criterios:

GRUPO I – Personas/pacientes con edad no superior al limite máximo de los cincuenta anos, clínicamente sanas, que no tengan en su historia clínica hábitos intestinales de defecación con cualquier episodio de pierda macroscópica de sangre en las heces, en los últimos tres anos, de las cuales se obtendrán muestras de heces;

GRUPO II – Muestras de heces de personas sometidas a rectosigmoidoscopia/colonoscopia con resultado macroscópico negativo para pólipos o formaciones polipoides;

GRUPO III – Muestras de heces y material de biopsia de personas sometidas a rectosigmoidoscopia/colonoscopia, con resultado macroscópico positivo para pólipos o formaciones polipoides;

GRUPO IV – Muestras de heces y material de biopsia de personas sometidas a rectosigmoidoscopia/colonoscopia con resultado macroscópico positivo para lesiones sospechas de cancer;

GRUPO V – Muestras de heces y material de biopsia de personas sometidas a rectosigmoidoscopia/colonoscopia, con resultado microscópico positivo para pólipos, formaciones polipoides, o lesiones sospechas de cancer;

GRUPO VI – Muestras de heces y material de biopsia de piezas operatorias de personas sometidas a cirugía de cancer colorectal.

El numero de muestras de personas dichas normales, y clínicamente sin quejas y sin síntomas atribuibles al trayecto del colon y recto, para calibración de la curva normal, no deberá ser inferior a 1000.

Se obtendrá de cada persona sana seleccionada, para el estudio de calibración de la curva normal, una muestra con intervalos de 3 meses, lo que significa que cada persona proporciona 4 muestras en cada ano.

El estudio para calibración descorrerá durante por lo menos dos anos, lo que significa que se obtendrán 8 muestras de heces de cada persona en un periodo de dos anos. De esta forma, serán garantidamente necesarias 150 a 200 personas voluntarias, en las condiciones descritas en el GRUPO I.

Las personas en las condiciones descritas en los GRUPOS II, III, IV, V y VI serán seleccionadas de INSTITUCIONES o SERVICIOS DE SALUD en donde se realicen colonoscopias y/o rectosigmoidoscopias, asi como cirugía de colon y recto relativamente al GRUPO VI.

PROCEDIMIENTOS PARA PREPARACIÓN Y CONTEO DE

RIBOSOMAS LIBRES

TÉCNICAS Y FASES PARA CONCRETIZACION DEL METODO

Para el recuento de ribosomas libres en la unidad de volumen bajo estudio se utilizarán las siguientes técnicas y/o fases:

01 – Cosecha de heces
02 – Colecta de colonocitos exfoliados
03 – Rotura de tejidos y células
04- Homogeneización
05 – Fraccionamiento subcelular
06 – Centrifugación
07- Sedimentación
08 – Centrifugación diferencial
09 – Equilibrio de sedimentación
10 – Preparación de ribosomas libres y marcación con fluorocromos
11- Recuento de ribosomas libres con utilización de citometria de flujo

01 – COSECHA DE HECES – COLECTOR DE HECES
Para la cosecha de la muestra de heces ha sido hecho design de un colector de heces, que es encajable en la apertura de la tasa del aseo, que contiene un dispositivo de cierre fácil, en material tipo-plástico opaco. De este forma el paciente produce una deyección singular de heces, en su casa, directamente para el recipiente adecuado (adaptable a la tasa y con cierre fácil, de tipo-cremallera), que es cerrado con seguridad, sin cualquier manipulación de heces, para ser enviado al laboratorio que ejecuta las técnicas del método.

02 – COLECTA DE COLONOCITOS ESFOLIADOS
Las heces son constituidas por uma mixtura de residuos alimentares no digeridos, microflora, secreciones endógenas y componentes celulares exfoliados del tracto intestinal.
Cuando los neoplasmas se desarrollan, las celulas de la mucosa y fragmentos de tejido son descamados y liberados en las heces en la luz intestinal, y asi se constituí la muestra para el teste.
Hay técnicas de aislamiento y colecta de colonocitos humanos exfoliados viables y intactos a partir de las heces, que están exhaustivamente estudiadas y standartizadas que, con las debidas adaptaciones, pueden ser utilizadas para la preparación y obtención de ribosomas libres (trabajos publicados, en anejo a la Tesis Doctoral).

03 – Rotura de tejidos y células
Todo proceso de fraccionamiento subcelular tiene dos etapas:
– Rotura de las células o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) en el que la fracción deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificación.
– Separación de la fracción deseada del resto de componentes de la célula o del tejido mediante algún criterio como puede ser una diferencia de densidad (centrifugación en gradientes o centrifugación diferencial), la presencia de algún antígeno, etc.
– Técnicas de rotura de células y tejidos. El primer paso en la purificación de la mayoría de las proteínas y estructuras subcelulares es la rotura de los tejidos o de las células para obtener un lisado celular en el que la proteína, el complejo multiproteico o la estructura subcelular se encuentre en condiciones que permitan su aislamiento. Esto se consigue empleando procedimientos mecánicos suaves conocidos generalmente como homogenización. Estos métodos producen la rotura de las membranas celulares, suavemente, con lo que se libera el contenido celular. Los procedimientos de homogenización más comunes son:
– Sonicación. Consiste en la aplicación de ultrasonidos a una suspensión celular. La intensa agitación producida destruye las membranas celulares. Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energía aplicada se pueden destruir asimismo las estructuras subcelulares e incluso solubilizar complejos proteicos. Se suele aplicar en frío para evitar el sobrecalentamiento de las muestras que podría provocar la desnaturalización de las proteínas.
– Uso de detergentes que solubilicen las membranas celulares. Se pasan las células a través de orificios de diámetros reducidos que provocan la rotura de las membranas celulares.

04 – Homogeneización
Para preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se debe suspender en un medio apropiado (una solución amortiguadora, salina ó azúcar isotónica). Para mantener la integridad de los organelos y enzimas durante el procedimiento de la fraccionación, todas las soluciones y cristalería deben mantenerse frías. Después de rebanar las hojas, el tejido está preparado para la homogenización, procedimiento que rompe los enlaces celulares y libera el contenido celular, sin dañar el medio en suspensión. La suspensión de células constituyentes se llama homogenizado.
Homogenizadores – se trata de romper las células con la ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a las gruesas paredes de un tubo de cristal especial, el homogenizador. Existen dispositivos de homogenización en los que está calibrada la separación entre el émbolo y la pared de cristal para producir homogenizados con un tamaño de partícula.

05 – Fraccionamiento subcelular
Con el fraccionamiento subcelular, que puede englobar un conjunto de métodos y técnicas, se tiene como objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas en un determinado componente celular, sea éste un orgánulo (mitocondrias, núcleos, peroxisomas, ribosomas…), una fracción de membrana (membrana total, plasmática, dominio basolateral, dominio apical,…), o complejos multiproteicos (citoesqueleto de actina, microtúbulos, poros nucleares, etc..).
El fraccionamiento subcelular es una técnica que consiste en la separación de los diferentes componentes celulares mediante la centrifugación diferencial. Para ello, las células se trituran y se centrifugan varias veces. En cada centrifugación se separa un orgánulo diferente de la célula (1º el núcleo). Se observa la velocidad a la que sedimenta cada orgánulo pudiendo saber el coeficiente de sedimentación expresado en unidades S (Svedberg) (Ej. ribosomas 70s). El fraccionamiento celular es usado para investigar la bioquímica y fisiología de organelos fuera del ambiente complejo de la célula intacta.

06 – Centrifugación
Centrífuga. Las centrífugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una densidad mayor que la del medio que las rodea. En general se diferencian en función de los márgenes de aceleración a que someten a las muestras en: centrífugas (de pocas g a aprox. 3000 x g), supercentrífugas (o centrífugas de alta velocidad, rango de 2000 x g a 20000 x g) y ultracentrífugas (de 15000 x g a 600000xg). En las centrífugas se suele controlar la temperatura de la cámara para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la fricción. En las ultracentrífugas, la velocidad extrema (más de 100000 rpm), hace que sea necesario hacer un intenso vacio en la cámara de la centrífuga para evitar el calentamiento de rotor y muestra. En una centrífuga el elemento 5 determinante es el rotor, dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos.
Los parámetros a tener presentes en cualquier centrifugación, que determinarán las condiciones son:
A – Volumen de solución a centrifugar, que determinará el tipo de tubos y rotores a emplear.
B – Naturaleza química de la solución, que determinará la naturaleza del tubo a emplear
C – Diferencial de densidad entre la partícula a sedimentar y la densidad del medio en el que se encuentra. En general cuanto mayor sea esa diferencia antes (menor tiempo y menor fuerza de aceleración) sedimentará. Cuando el diferencial es muy pequeño se pueden aplicar centrifugaciones de cientos de miles de g durante horas. – Centrifugación. Debido a las diferencias en tamaño y densidad, cada componente celular está sujeto a una fuerza centrífuga. La fuerza generada por la centrífuga se expresa como fuerza centrífuga relativa (RCF) en unidades de g. La RCF es una función de velocidad de centrifugación en revoluciones por minutos (rpm) y la distancia de partículas desde el eje de rotación.

07- Sedimentación
Velocidad de sedimentación

Es posible aprovechar la diferencia de la velocidad necesaria para sedimentar las partículas para realizar una centrifugación en un medio en el que exista un gradiente de densidad, siendo menor en la parte superior y mayor en la inferior. Después de un tiempo las diferentes poblaciones de partículas se sitúan en diferentes profundidades 5 del tubo. Haciendo un pequeño orificio en el fondo del mismo se pueden recoger diferentes fracciones que contengan a las distintas poblaciones separadas. Este es el fundamento de la ultra-centrifugación preparativa, que permite determinar la velocidad de sedimentación de una partícula (medida en unidades Svedverg, S). Una vez obtenido el lisado u homogeneizado celular se ha de proceder a su fraccionamiento. Una de las técnicas más empleadas es la centrifugación. Se basa en hacer girar el tubo a gran velocidad de forma que se produzca la acumulación en el fondo del mismo de las partículas que tienden a hundirse por tener una densidad mayor que la del medio en que se encuentran. Así, después de la centrifugación la muestra, homogénea, se habrá separado en dos fracciones: sobrenadante (‘supernatant’), fracción homogénea que no ha sedimentado y el sedimento (‘pellet’) que ha quedado adherida al fondo del tubo.

08- Centrifugación diferencial
. Centrifugación diferencial: En la centrifugación diferencial, el homogeneizado es centrifugado repetidas veces a altas velocidades, sedimentándolo progresivamente en pequeñas partículas. La primera centrifugación es a 600g por 10 minutos, el cual sedimenta la fracción nuclear. Este “pellet” o bola contiene el núcleo, células intactas y tejido. La próxima separación es el sobrenadante postnuclear ó partículas suspendidas en líquido sobre el “pellet” nuclear, el cual es transferido a otro tubo de centrífuga y se centrífuga a 10,000 g por 30 minutos en una centrífuga refrigerada. El material sedimentado se conoce como fracción mitocondrial; éste contiene mitocondria y micro cuerpos. La centrifugación diferencial se basa en la existencia de diferentes partículas en la suspensión que difieren en su densidad de la del medio. Si se centrifuga en condiciones suaves (poco tiempo, poco fuerza de aceleración) sedimentarán las partículas mayores y/o más densas. Cuando el sobrenadante de la primera centrifugación es centrifugado de nuevo en condiciones de más tiempo y más fuerza de aceleración, se sedimentan de nuevo las partículas más densas presentes y así sucesivamente. Se pueden aplicar condiciones crecientes de severidad en la centrifugación y obtener una colección de sedimentos que corresponden sucesivamente a fracciones de partículas de diferente tamaño y/o densidad.

09- Equilibrio de sedimentación

Equilibrio de sedimentación: Es un sistema que se suele realizar empleando la ultracentrífuga. Consiste en la separación de las partículas en función de su densidad de flotación. La muestra se dispone por encima o se mezcla con un gradiente de densidad más pronunciado que el del caso anterior, y que contiene una concentración muy elevada de sacarosa o de cloruro de cesio. Al centrifugar cada componente subcelular se desplazará hacia arriba o hacia abajo hasta que alcance una posición en la que su densidad sea igual a la de su entorno (situación de flotabilidad neutra) y ya no se desplazará más. Como consecuencia se producirán una serie de bandas discretas, las más próximas l fondo del tubo contendrán las partículas con mayor densidad de flotación. Este método también se conoce como equilibrio en gradiente de densidad.
Se emplean diferentes sustancias para conseguir los gradientes de densidad, como son sacarosa, percol, cloruro de cesio,… Los gradientes pueden ser autogenerados como es el caso de los basados en cloruro de cesio en que se forman en el propio proceso de centrifugación, o preformados como es el caso de la sacarosa o del percol. En este último caso la preparación se realiza antes de la centrifugación mediante un formador de gradientes, dispositivo que consiste en dos cubetas conectadas por la base y con agitación en las que se colocan las soluciones con los dos extremos de concentración. A medida que se va sacando de una de ellas la otra reemplaza el líquido extraído y modifica linealmente la concentración.
– Una alternativa es la centrifugación en gradiente discontinuo, en la que se crea un gradiente por etapas en el interior de un tubo al apilar sucesivamente volúmenes homogéneos de soluciones de diferente densidad. En las interfases de las diferentes capas se acumularán las partículas que flotan (son menos densas) en la capa inferior pero que se hunden (son más densas) en la capa superior.

10 – Preparación de ribosomas libres y marcación con fluorocromos
Marcación de ribosomas: cabe señalar que la traducción de la información genética en polipéptidos por el ribosoma es un proceso celular universal y fundamental. La evidencia estructural y bioquímica del ribosoma soporta fuertemente la dinámica de su importancia funcional durante la síntesis proteica. Están descritas técnicas clásicas de biología molecular celular que permiten separar los ribosomas (libres y ligados a membranas) de otros organelos subcelulares. Hay varios estudios que describen distintos modos de marcación de ribosomas. La preparación de ribosomas, según el tejido en estudio, se puede hacer a través de algunas modificaciones de adaptación, publicadas en estudios previos.

11- Recuento de ribosomas libres con utilización de citometria de flujo